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實驗概要

本實驗利用3,5－二硝基水楊酸法測定了藕粉和淀粉中的總糖和還原糖。有助于掌握還原糖和總糖的測定原理，學(xué)習(xí)用比色法測定還原糖的方法。

實驗原理

在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。

在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。

主要試劑

1. 3,5－二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取6.5g DNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氫氧化鈉溶液325mL，再加入45g丙三醇，搖勻，冷卻后定容至 1000mL。

2. 葡萄糖標準溶液：準確稱取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100mL，即含葡萄糖為2.0mg/mL。

3. 6mol/L HCl：取250mL濃HCl（35%～38%）用蒸餾水稀釋到500mL。

4. 碘－碘化鉀溶液：稱取5g碘，10g碘化鉀溶于100mL蒸餾水中。

5. 6mol/L NaOH：稱取120g NaOH溶于500mL蒸餾水中。

6. 0.1% 酚酞指示劑。

主要設(shè)備

1. 試管1.5×15cm（×13）, 3.0×20cm（×1）；

2. 移液管0.2mL（×2），0.5mL（×2），1mL（×5）， 10mL（×1）；

3. 水浴鍋；

4. 電爐；

5. 分光光度計。

實驗材料

藕粉，淀粉。

實驗步驟

1. 葡萄糖標準曲線制作

取6支1. 5 cmm×1.5cm試管，按下表加入2.0mg/mL葡萄糖標準液和蒸餾水。

在上述試管中分別加入DNS試劑2.0mL，于沸水浴中加熱2min進行顯色，取出后用流動水迅速冷卻，各加入蒸餾水9.0mL，搖勻，在 540nm波長處測定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。

2. 樣品中還原糖的提取

準確稱取0.5g藕粉，放在100mL燒杯中，先以少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加入約40mL蒸餾水，混勻，于50℃恒溫水浴中保溫20min，不時攪拌，使還原糖浸出混。過濾，將濾液全部收集在50mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即為還原糖提取液。

3. 樣品總糖的水解及提取

準確稱取0.5g淀粉，放在大試管中，加入6M HCl 10mL，蒸餾水15mL，在沸水浴中加熱0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍色。水解畢，冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6M NaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到100mL，過濾取濾液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測定。

4. 樣品中含糖量的測定

取7支15mm×150mm試管，分別按下表加入試劑：

加完試劑后，于沸水浴中加熱2min進行顯色，取出后用流動水迅速冷卻，各加入蒸餾水9.0mL，搖勻，在540nm波長處測定光吸收值。測定后，取樣品的光吸收平均值在標準曲線上查出相應(yīng)的糖含量。

5. 計算

按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百分含量：

式中：C──還原糖或總糖提取液的濃度，mg/mL；

V──還原糖或總糖提取液的總體積，mL；

m──樣品重量，g；

1000──mg換算成g的系數(shù)。

注意事項

標準曲線制作與樣品含糖量測定應(yīng)同時進行，一起顯色和比色。