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實驗概要

本實驗介紹了氨基酸離子交換柱色譜分離實驗的原理及操作步驟等。

實驗原理

有些高分子物質含有一些可以解離的基團，例如-SO₃H，-COOH等，因此可以和溶液中的離子產生交換反應如：

R-SO₃H M→R-SO₃M H

或 R-NH₃OH Cl^-→R-NH₃Cl OH^-

這類同分子物質通稱離子交換劑，其中使用最普遍的是離子交換樹脂。由于一定的離子交換劑對不同離子的靜電引力不同，因此在洗脫過程中，不同的離子在離子交換柱上的遷移速度也不同，最后完全分離。

本實驗采用磺酸型陽離子交換樹脂(732型)分離酸性氨基酸(天冬氨酸Asp pI=2.97)和鹼性氨基酸(賴氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3條件下，因為低于Lys的pI值，Lys可解離成陽離子掛在樹脂上；高于Asp的pI值，則Asp可解離為陰粒子，不能被樹脂吸附而直接流出色譜柱。在pH 12條件下，因高于Lys的pI值，Lys又解離為陰離子從樹脂上被交換下來，這樣通過改變洗脫液的pH值可使它們被分別洗脫而達到分離的目的。

主要試劑

1. 樹脂：磺酸型陽離子交換樹脂(732型)

2. 洗脫液：0.45mol/L、pH5.3檸檬酸緩沖液，取285克檸檬酸(C₆O₇H₈·H₂O)；186克 97%NaOH； 105ml濃鹽酸溶于水稀釋至10升。

0.01mol/L pH12 NaOH緩沖液，取4克NaOH溶于10升蒸餾水。

3. 樣品液：0.005mol/L Asp和Lys的0.02mol/L HCl混合溶液。

4. 顯色劑：三氯化鈦——茚三酮溶液：

醋酸緩沖液：水150ml，無水醋酸鈉82克，無水醋酸25ml，用水定容250ml pH5.5。

乙二醇甲醚750ml，加入茚三酮20克，三氯化鈦(TiCl₃15%)1.7ml，用醋酸緩沖液定溶到1升。

主要設備

1. 玻璃色譜柱：長19cm，內徑1.2cm，3#砂芯。

2. 恒流泵(微量輸液器)。

3. Bs-160型部分收集器或以刻度試管手工操作。

4. 722型分光光度計。

5. 刻度吸管、試管。

6. 水浴鍋。

實驗步驟

1．樹脂的處理

關于市售新樹脂的處理見注1，關于樹脂浮洗的方法參照講義所述，本實驗采用處理好的樹脂。

2．裝柱：將色譜柱垂直裝好，關閉柱底出口，在柱內注入約2cm高pH5.3的檸檬酸緩沖液。

將浮選后已轉成鈉型的樹脂置于燒杯中，加進1~2倍體積的檸檬酸緩沖液，經抽氣處理后，攪成懸浮狀沿柱內壁細心地把柱灌滿。倒時不要太快，以免產生泡沫。待樹脂在柱底部逐漸沉積2~3cm高時，用吸管吸去柱內上層所出現的清液，慢慢打開柱底出口，繼續加注樹脂懸液，直至柱體裝到8cm高度為止。

在裝柱時要避免使柱內液體流干而使裝柱失敗，另外樹脂懸液的溫度要相對恒定(特別是對于采用高溫法)。裝好的柱體應該沒有紋路，沒有裂痕，沒有氣泡和柱頂表面平整而均勻，這樣方可投入使用，否則要重裝。

3．平衡：柱裝好后接上預先調好的恒流泵，用檸檬酸緩沖液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH與洗脫液的pH相同為止(用pH試紙檢查)，這大約需要2~3倍床體積。

4．加樣與洗脫：移去柱上的液器塞，打開柱底出口，小心使柱內液體流至柱表面時即行關閉。用加樣吸管吸取0.5ml氨基酸混合樣品溶液。沿柱壁小心地加入柱中，加樣時不要過快，以免沖壞樹脂表面，加樣后慢慢打開柱底閥，使液面再與樹脂面相齊時關閉，然后再用吸管吸取適量洗脫液如此清洗柱內壁四周1~2次。洗滌后，用緩沖液在柱內加到約2cm高的液層，然后接上恒流泵，調流速0.5ml/分即開始洗脫。

注意在調節流速時要排除恒流泵與柱之間連接管內的所有氣泡，并且在調節時不要過猛，以免影響色譜行為。

5．收集：柱流出液可用自動分部收集器或以刻度試管人工收集按每管3ml先收集4管。

6．改換高pH洗脫收集：關閉恒流泵及柱底閥，將恒流泵管內的檸檬洗脫液更換成pH12 NaOH洗脫液，然后按上面同樣方法繼續收集到第5管到10管。

7．測定：(注2)將收集的各管編號后，分別取0.5ml收集液于一潔凈的干試管中，加入1ml pH5.3檸檬酸洗脫緩沖液，0.5ml茚三酮試劑，混合后在100℃水浴上加熱25分鐘。然后水冷卻5~10分鐘，加3ml60%乙醇稀釋，搖勻后用721型分光光度計在570nm處比色。

測定后，以光密度為縱坐標，收集的管數或毫升數為橫坐標繪制洗脫曲線。

8．再生：對于裝好的柱使用幾次后需用0 .2mol/L NaOH溶液洗脫，再用蒸餾水洗至中性后重復使用。

注意事項

1. 對于市售的干樹脂其處理方法為：先經水充分溶脹后，傾去上面的泥狀細粒，反復洗幾次直到水澄清為止，然后經浮選得到顆粒大小合適的樹脂，浮選后用4倍量的2mol/LHCl和2mol/L NaOH依次浸洗，每次半小時，換酸或堿時要用水先將樹脂洗至中性。最后樹脂應處理至溶液無黃色。這時再用1mol/L NaOH使樹脂轉成鈉型(對于其它的轉型要視實驗和樹脂的情況而定)，以蒸餾水洗至中性備用。

2．氨基酸的測定一般要求在pH5左右，這樣在本實驗中，改變pH后的洗脫液就不能直接進行測定。所以在第7步測定時要加入1ml pH5.3的檸檬酸緩沖液。