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實驗概要

本實驗介紹了氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心法(即連續梯度法)純化閉環DNA的原理及操作步驟等。

實驗原理

用含氯化銫和溴化乙錠的懸浮密度梯度離心法分離質粒和染色體 DNA 的方法，取決于線性 DNA 和閉環 DNA 結合的溴化乙錠的量的差異。
許多年來，純化大量質粒 DNA 的首選方法是 CsCl- 溴化乙錠梯度密度離心法.但由于這種方法耗時費錢，于是發展了許多其他方法，包括差異沉淀法和柱層析法.盡管如此，許多堅持傳統的人仍然認為，用 CsCl- 溴化乙錠梯度密度離心法純化的質粒 DNA 是最純最好的.由于用 CsCl- 溴化乙錠梯度密度離心法純化的閉環 DNA 有宿主菌的小片段 DNA 和 RNA 的污染，這些小片段比質粒 DNA 需要更長的是 ianzaiCsCl- 溴化乙錠梯度中達到平衡.因此當閉環 DNA 達到平衡時，小片段分子仍在不同梯度均與分布.這一問題可以通過一些兩種辦法來解決：采用商品化的樹脂柱層析法取代 CsCl- 溴化乙錠梯度密度離心法，或將 CsCl- 溴化乙錠梯度密度離心得到的閉環質粒 DNA 進行第二輪 CsCl- 溴化乙錠梯度密度離心。
另一種方法稱為不連續 CsCl 梯度離心法： CsCl 溶液在離心管中按三種不同濃度分層排布，經離心，CsCl 梯度的形成更可，離心時間縮短到 6h。但是，不連續 CsCl 梯度離心法將閉環質粒 DNA 與染色體及開環質粒 DNA 分離的效果不如連續梯度離心法。
在下述連續梯度離心中，將溴化乙錠和粗制質粒 DNA 與密度約為 1.55 的 CsCl 溶液混勻.當混合物以高速離心時，離心力足以產生并維持銫離子的梯度.在梯度形成過程中，不同浮力密度的 DNA 進入與其帶有相同密度的 CsCl 層.欲達平衡梯度，以往需要離心 24-28h；但由于現代的垂直管轉頭離心力高，直徑小，因而其梯度的形成比用舊事的低速固定角度的轉頭快的多。

主要試劑

1. CsCl （固體）

2. CsCl 再分帶溶液

3. 乙醇

4. 溴化乙錠（ 10mg/ml ）

5. 石蠟油

6. 核酸和寡核苷酸

7. 粗制質粒

主要設備

1. 離心機和轉子，Sorvall-SS34 或與其相當的轉頭

超速離心機轉頭（最好用垂直式）和離心管，如果離心時間不是限制因素，可用 Beckman Vti65、角度專題 Ti50、 Ti65、 Ti70或Sorvall的相當產品.使用可快封的 polyallomer 管或相當產品。
2. 皮下注射針頭（ 21 號）

3. 巴斯德吸管或配大口徑針頭的一次性注射器
4. 折光儀（可選），盡管并非必需，折光儀在估計 CsCl 溶液密度時十分有用
5. 帶有 18 皮下注射針頭的一次性注射器（5-10ml ，無菌）

實驗步驟

1. 測定粗制質粒 DNA 的量。最好通過向一個已在天平上調零的潔凈管中加入溶液來測定，每克質粒 DNA 溶液中準確加入 1.01g 固體 CsCl ，閉上管蓋以防蒸發，于 30℃溫育促使 CsCl 溶解.輕輕混合溶液直到 CsCl 溶解。
每個梯度的 DNA 用量宜來自不超過 50ml 過夜培養物的粗提質粒。因為 Beckman Vti65.2 轉子的垂直離心管只可容納約 5mlCsCl- 溴化乙錠溶液，所以來自 50ml 培養物的粗提質粒 DNA 應重溶于約 3mlTE （ ph8.0 ）中。
2. 向每 5gDNA 原液中加入 100ul 10 mg/ml 的溴化乙錠溶液。
溶液的終密度應約為 1.55g/ml，（折射率為 1.3860 ），溴化乙錠的濃度約為 200ug/ml。以往曾認為，欲使溴化乙錠與閉環 DNA 和線狀 DNA 的結合達飽和，大劑量的溴化乙錠是必需的，所以溴化乙錠的用量要大得多。然而，由于高濃度未結合的溴化乙錠可能會使微弱的 DNA 區帶模糊不清以致在紫外線下才能看到.因而近年來成功使用低濃度的溴化乙錠，使得 DNA 區帶在可見光下顯現.不過當含有低濃度溴化乙錠的梯度載有過量核算時，又會出現問題：在這種情況下，可能沒有足夠的溴化乙錠與閉環 DNA 和線狀 DNA 達飽和結合。因為在 CsCl- 溴化乙錠梯度中大多數溴化乙錠不是與 DNA 而是與存在于粗制質粒 DNA 的細菌 RNA 結合，所以在超速離心之前用不含 DNA 酶的 RNA 酶處理粗制品，此問題可予解決。如果來自 50ml 細菌培養物的粗提質粒 DNA 用 3ml TE （ ph8.0 ）重溶，再用來制備一個 5ml 的 CsCl- 溴化乙錠梯度，則該處理通常不是必需的。
3. 如果使用 Corex 玻璃管，將溶液于溫室用 7700g(8000r/min，Sorvall-SS34 轉子 ) 離心 5min ；如果使用一次性聚丙烯管，則用 1100g （ 3000r/min，Sorvall-SS34 轉子 ) 離心 10min。
浮在離心管頂部的暗紅色渣滓是溴化乙錠和細菌蛋白形成的復合物，離心管底部的沉淀是宿主菌被 SDS 和（或）熱裂解而產生的碎片.當宿主菌被 SDS 或煮沸裂解時常會遇到這些棘手的問題，而用堿裂解法產生的碎片 iaoshao。
4. 用巴斯德吸管或帶大號針頭的遺傳學注射器將浮渣之下，沉淀智商的清亮紅色溶液轉移到適用于超速離心轉子的離心管中，用輕石蠟油或重新分層溶液加滿該離心管.離心時確保轉子中離心管重量的平衡。按照廠家說明密封離心管。
5. 用適當的轉子與 20 ℃進行密度梯度離心。
Beckman NVT65 轉子 366000 （ 62000r/min ） 6h
Beckman VTi65 轉子 194000 （ 45000r/min ） 16h
Beckman Type 50Ti 轉子 180000 （ 45000r/min ） 48h
Beckman Type 65Ti 轉子 314000 （ 60000r/min ） 24h
Beckman Type 70.1Ti 轉子 331000 （ 60000r/min ） 24h
6. 離心結束后，從離心機上輕輕取下轉子水平放置.小心取出每個離心管，放于附有錫箔的試管架上.在僅有微光的室內（即關閉頭頂的日光燈），將離心管放在鐵架臺的鐵箍上。
在普通光找下，于梯帶中心可見兩條 DNA 區帶，上層區帶的內含物通常較少，由線狀的細菌（染色體） DNA 和帶切開的環狀質粒 DNA 組成：下層區帶則有閉環質粒 DNA 組成.管底的深紅色沉淀是溴化乙錠和 RNA 的復合物，位于 CsCl 溶液和石蠟油之間的物質是蛋白質。
如果質粒 DNA 的產量較低，可用手提式長波紫外燈檢測離心后的 DNA ，可將其與含有分離好的 DNA 的離心管裝在同一鐵架臺的鐵箍上.紫外燈照射的離心管上可使溴化乙錠和 DNA 的復合物發出明亮的橘紅色熒光，有助于用針頭或注射器將其吸取.如使用紫外燈，引物質粒 DNA 過度暴露于紫外線下會遭破壞，故應盡快收獲質粒 DNA .此外，應帶上面罩以防眼睛受到紫外燈傷害.雖然長波紫外線照射引起的傷害較短波小，但依然能夠損傷眼睛。
7. 收集閉環 DNA 區帶。
   1）用 21 號皮下注射針頭在離心管頂端扎一個小孔以使液體被吸出空氣能進入。
   2) 用乙醇小心擦拭離心管外壁以除去任何油脂，然后用一塊 Scotch 膠帶或 Time 較大貼于管外壁。膠帶起密封作用以減少針頭穿刺后的泄露。
   3) 將一個 5-10ml 的一次性注射器裝上一個無菌的 18 號皮下注射針頭，將針頭斜面向上地穿過膠帶插入管中，以使針頭的斜面開口正好位于較低的 DNA 區帶（閉環質粒 DNA ）的下方。
   4) 緩慢吸出質粒 DNA ，小心不要攪動上方黏稠的染色體 DNA 區帶。
欲避免染色體 DNA 的污染，不要試圖從梯帶中移去每一點可見的痕量閉環質粒 DNA 。
有些研究者喜歡移去較低的閉環質粒 DNA 區帶之前先去除較上方的 DNA 區帶。此法不太可取，這是因為位于較上層的黏稠的高分子質量染色體 DNA 能纏繞住閉環質粒 DNA 并將其帶出離心管。
8. 從 DNA 中去除溴化乙錠。
為了減少閉環 DNA 區帶中染色體 DNA 和 RNA 片段的污染，可將閉環 DNA 重新分層。欲使質粒 DNA 重新分層，應將注射器中的內含物緩慢轉移至一個新的可快速密封的 polyallomer 離心管中，在裝滿 CsCl 重分區帶溶液。密封離心管，再次離心，用如上所述步驟 5-7 回收閉環質粒。從 DNA 中去除溴化乙錠。