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實(shí)驗(yàn)概要

認(rèn)識真核生物RNA的組成及分離的原理；學(xué)習(xí)RNA提取過程中抑制RNA酶活性的方法。

實(shí)驗(yàn)原理

真核生物的RNA包括rRNA、tRNA和mRNA。一個(gè)典型的真核細(xì)胞約含有10-5~10-6mg的RNA，其中80-85%為rRNA，其余15-20%主要由各種低分子量RNA組成（如tRNA、核內(nèi)小分子RNA等），細(xì)胞的RNA大多都與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，但這種結(jié)合很容易在變性劑存在下打破。在經(jīng)有機(jī)溶劑抽提后，用乙醇或異丙醇可將其從上清中沉淀出來。

RNA提取中要嚴(yán)格避免RNA酶的污染，因?yàn)镽NA酶極穩(wěn)定，通常的消毒方法難以將其滅活，而空氣中細(xì)菌、真菌和操作者都有可能成為RNA酶的污染源。RNA酶污染會使分離的RNA大量降解。

對于rRNA和tRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，當(dāng)總RNA分離出來后還能用電泳、密度梯度離心、層析等方法加以進(jìn)一步分離純化。而mRNA的分離將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中做到。

主要試劑

1. 異硫氰酸胍

2. CSB（檸檬酸/十二烷基肌氨酸鈉/b-巰基乙醇）緩沖液

3. 2mol/L NaAc pH 4.0

4. 酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）

5. 異丙醇

6. 75%乙醇

7. DEPC H₂O等

主要設(shè)備

1. 瓷研缽（組織搗碎機(jī)）

2. eppendorf離心管

3. 冷凍臺式離心機(jī)

4. 液態(tài)氮

5. 剪刀

6. 一次性手套

7. 恒溫水浴鍋

8. 真空干燥儀

9. 紫外分光光度計(jì)

10. 凝膠電泳裝置

11. 凝膠成像系統(tǒng)等。

進(jìn)行RNA提出的所有器皿必須保證未受RNA酶的污染，玻璃、瓷器和金屬耐熱器皿應(yīng)先以0.1%DEPC（二乙基焦碳酸鹽）水溶液浸泡2hr，然后以鋁箔包裹后在180℃烘烤過夜。使用新的塑料制品，并將其在0.1%DEPC中浸泡2hr并經(jīng)高壓蒸汽消毒30min。操作過程中還應(yīng)嚴(yán)格避免外源RNA酶的污染。

實(shí)驗(yàn)材料

水稻幼苗，剪取幼芽。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 稱取材料0.1g，剪成約2mm長段，加入液氮研磨成細(xì)粉狀。

2. 加入0.2g異硫氰酸胍和2ml CSB緩沖液，繼續(xù)研磨成勻漿。

3. 將勻漿轉(zhuǎn)移至兩個(gè)eppendorf管中，加入0.12ml NaAc，加蓋后反復(fù)顛倒離心管20次。

4. 每管加入1ml酚：氯仿：異戊醇，混勻后劇烈震動10sec，冰浴15min。

5. 10，000g，4℃離心15min。

6. 小心將上層水相轉(zhuǎn)移至新管中，注意不要吸動中間層。中間層富含蛋白質(zhì)和DNA。

7. 加入等體積的異丙醇，混勻后置-20℃放置30min以沉淀RNA。

8. 10，000g，4℃離心20min沉淀RNA。

9. 棄上清，將RNA沉淀懸浮到0.5ml CSB溶液中，搖動溶液至RNA溶解。

10. 加入等體積的酚:氯仿:異戊醇重新抽提一次，即重復(fù)4—8的步驟。

11. 離心后棄上清，沉淀用0.5ml預(yù)冷的75%乙醇漂洗一次。離心后棄上清，真空初步干燥沉淀。

12. RNA溶解在0.2ml  DEPC水中，用紫外分光光度計(jì)測定260nm、280nm、及230nm波長的光密度，獲得RNA的濃度和純度。

注意事項(xiàng)

1. RNA的濃度C=A260×40×測定稀釋倍數(shù)（ug/ml），純RNA的A260/A280比值在1.7-2.0之間，若低于該值范圍，表明有蛋白質(zhì)污染，應(yīng)重新進(jìn)行有機(jī)溶劑抽提。若高于該范圍，可能有異硫氰酸胍的殘留或有核酸的嚴(yán)重降解，應(yīng)重新進(jìn)行醇沉淀的步驟。

2. 當(dāng)前有很多生物技術(shù)公司生產(chǎn)分離RNA的試劑盒，如Trizol試劑，將異硫氰酸胍、CSB及苯酚混合在一起，按一定的體積與材料研磨后，即可通過氯仿抽提和乙醇沉淀RNA，可很方便地進(jìn)行RNA的分離。