實驗概要
本文介紹了唾液淀粉酶活性觀察的原理及方法步驟等。
實驗原理
酶是指化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)的生物催化劑。在一定條件下，酶促化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的能力即稱為酶活性(酶活力)。影響酶活性的因素是多方面的，如溫度、PH及某些化學(xué)物質(zhì)等都會影響酶的催化活性。在一定條件下，能使酶活性達(dá)到最高時的溫度即酶的最適溫度，而能使酶活性達(dá)到最高時的PH即酶的最適PH。例如，唾液淀粉酶的最適溫度是37℃，而其最適PH是6.8。能增高酶活性的物質(zhì)稱為酶的激活劑，能降低酶活性卻又不使酶變性的物質(zhì)叫酶的抑制劑。凡能使蛋白質(zhì)變性的因素都可以使酶變性而喪失活性。
酶活性通常是通過測定酶促化學(xué)反應(yīng)的底物或產(chǎn)物量的變化來進(jìn)行觀察的。
本實驗用唾液淀粉酶為材料來觀察酶活性受理化因素影響的情況。唾液中含有唾液淀粉酶。淀粉在該酶的催化作用下會隨著時間的延長而出現(xiàn)不同程度的水解，從而得到各種糊精乃至麥芽糖、少量葡萄糖等水解產(chǎn)物。而碘液能指示淀粉的水解程度——淀粉遇碘可呈紫色、暗褐色與紅色，而麥芽糖與葡萄糖遇碘則不呈顏色反應(yīng)，如圖所示：
題-1.jpg "雙擊查看原圖")
主要試劑
1. 0.5%(W/V)淀粉溶液：稱取0.5g可溶性淀粉，加少量預(yù)冷的蒸餾水，在研缽中調(diào)成糊狀，再徐徐倒入約90ml沸水，同時不斷攪拌，最后加水定容為100ml即成。要求新鮮配制。
2. 稀碘溶液：稱取1.2g I2、2g KI，加少量蒸餾水溶解后，再加蒸餾水至200ml。保存于棕色瓶中，用前5倍稀釋。
3. 不同PH溶液：
A液—0.2mol/L Na2HPO4溶液：稱取35.62g Na2HPO4·12H2O，將之溶于蒸餾水后定容至1000ml。
B—0.1mol/L檸檬酸溶液：稱取19.212g無水檸檬酸，將之溶于蒸餾水后定容至1000ml。
1) PH5.0緩沖液——取A液10.3ml、B液9.7ml混合而成。
2) PH6.8緩沖液——取A液14.55ml、B液5.45ml混合而成。
3) PH8.0緩沖液——取A液19.45ml、B液0.55ml混合而成。
4. 0.5%(w/v)蔗糖溶液：稱取蔗糖0.5g，將之溶于蒸餾水后定容至100ml。
5. 斑氏試劑：
A液—稱取無水CuSO417.4g，將之溶于100ml預(yù)熱的蒸餾水中，冷卻后用蒸餾水稀釋至150ml。
B液—稱取檸檬酸鈉173g、Na2CO3100g，再加蒸餾水600ml，加熱溶解后冷卻，用蒸餾水稀釋至850ml。
將A液與B液混合即得斑氏試劑。
6. 1%(w/v)NaCl溶液：稱取NaCl 1g，將之溶解后用蒸餾水稀釋至100ml。
7. 1%(w/v)CuSO4溶液：稱取無水CuSO4 1g，將之溶解后用蒸餾水稀釋至100ml。
主要設(shè)備
1. 白瓷板(或比色板)
2. 恒溫水浴鍋
3. 電爐
實驗步驟
1．唾液淀粉酶應(yīng)用液的制備
1) 每人取一個干凈的飲水杯，裝上蒸餾水。
2) 先用蒸餾水漱口，將口腔內(nèi)的食物殘渣清除干凈。
3) 口含約20ml蒸餾水，做咀嚼動作1~2min，以分泌較多的唾液。然后將口腔中的唾液吐入一個干凈的小燒杯中。
4) 取一塊干凈的白瓷板，按下表操作：
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穴號
試劑(滴)
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1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
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|
蒸餾水(ml)
|
2
|
2
|
2
|
2
|
2
|
2
|
棄去
|
|
唾液[注2](滴)
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2→
|
2→
|
2→
|
2→
|
2→
|
2→
|
|
0.5%淀粉溶液(ml)
|
2
|
2
|
2
|
2
|
2
|
2
|
|
碘液[注3](滴)
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1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
觀察結(jié)果(顏色)，以呈棕紅色者濃度為準(zhǔn)，稀釋原唾液作應(yīng)用液。
2．溫度對酶活性的影響
1) 取3支試管，按下表進(jìn)行實驗。
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試管編號
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1
|
2
|
3
|
|
0.5%淀粉(ml)
|
5
|
5
|
5
|
|
PH6.8緩沖液(ml)
|
0.5
|
0.5
|
0.5
|
|
稀釋唾液(ml)
|
0.5
|
0.5
|
0.5
|
|
不同溫度(℃)
|
置冰水浴中
|
置37℃水浴中
|
置沸水浴中
|
將各管中的試劑加好后混勻，然后及時在上述溫度下分別進(jìn)行處理。
2) 在干凈的比色板上，于各孔穴中分別滴加2滴碘液。
3) 每隔1min從第2支試管中取反應(yīng)液1滴，與比色板孔穴中的碘液混合，觀察顏色的變化。
4) 待第2支試管中的反應(yīng)液與比色板孔穴的碘液混合后顏色不再變化時，取出試管，并將在沸水浴中處理的試管用冷水冷卻，然后向各試管中滴加碘液1~3滴。
搖勻后觀察并記錄各管顏色，比較管中淀粉水解的程度，說明溫度對酶活性的影響。
3．PH對酶活性的影響
1) 取3支試管，按下表編號進(jìn)行實驗。
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管號
|
1
|
2
|
3
|
|
0.5%淀粉(ml)
|
2
|
2
|
2
|
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不同PH的緩沖液(ml)
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PH5.0
PH6.8
PH8.0
|
2
|
—
|
—
|
|
—
|
2
|
—
|
|
—
|
—
|
2
|
|
稀釋唾液(滴)
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10
|
10
|
10
|
搖勻后，將各管置于37℃水浴中處理。
2) 每隔1min從PH6.8的試管中取出1滴反應(yīng)液滴于白瓷板上，隨后滴加稀碘液1滴，觀察其顏色變化。
3) 待顏色呈棕色時，向各管中加稀釋碘液1~3滴。觀察各管顏色，比較各管中淀粉水解的程度，解釋PH對酶活性的影響。
4．酶反應(yīng)的特異性
1) 取2支試管，按下表編號后進(jìn)行實驗。
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試管號
|
1
|
2
|
|
0.5%淀粉(ml)
|
2
|
—
|
|
0.5%蔗糖(ml)
|
—
|
2
|
|
稀釋唾液(ml)
|
1
|
1
|
2) 搖勻后，將各管置于37℃水浴中處理10min。
3) 取出試管，分別加入斑氏試劑2ml，混勻。
4) 將各管置于沸水浴中煮沸2~5min。觀察并解釋結(jié)果。
5．激活劑與抑制劑對酶活性的影響
1) 取3支試管，按下表編號后進(jìn)行實驗。
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管號
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1
|
2
|
3
|
|
0.5%淀粉(ml)
|
3
|
3
|
3
|
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PH6.8緩沖液(ml)
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0.5
|
0.5
|
0.5
|
|
1%NaCl溶液(ml)
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—
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1
|
—
|
|
1%CuSO4溶液(ml)
|
—
|
—
|
1
|
|
蒸餾水(ml)
|
1
|
—
|
—
|
|
稀釋唾液(ml)
|
1
|
1
|
1
|
2) 將各管搖勻后，一起放入37℃水浴中保溫。
3) 每隔1min從第1支試管中取出1滴反應(yīng)液滴于白瓷板上，隨后滴加稀碘液1滴于此滴反應(yīng)液中，觀察其顏色變化。
4) 待加碘后顏色呈棕色時，取出3支試管，分別加入稀碘液1~3滴。觀察、比較各管顏色的深淺，并解釋之。
注意事項
1. 可以根據(jù)實際情況，用紗布或濾紙過濾一下收集濾液使用。
2. 加唾液時，只在第1穴中加入2滴新制備的唾液。將之與該穴中的蒸餾水混勻后，取出2滴加入第2穴中。待混勻后又從第2穴中取出2滴加入第3穴。如此繼續(xù)操作，直到從第6穴中取出2滴棄去。待穴中顏色呈紅棕色時，即可照該穴中唾液的稀釋度稀釋制備的唾液，并用稀釋好的唾液進(jìn)行下面的實驗。
3. 在往白磁板的孔穴內(nèi)依次加完蒸餾水、稀釋好唾液并且加完淀粉溶液之后，加入碘液之前，應(yīng)放置5min。
4. 為確保實驗的效果，在加入試劑時宜在冰浴條件下進(jìn)行，尤其是氣溫較高的南方地區(qū)要注意。
5. 加唾液時應(yīng)從第1管開始依次進(jìn)行，前后管之間大約相隔時間5~7s。
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